科研团队揭示PAD2影响阿尔兹海默症的分子机制

福建医科大学团队通过蛋白质组学、行为和病理学分析、单细胞转录组测序（scRNA-seq）、RNA-seq等技术，揭示星形胶质细胞中的PAD2是AD中小胶质细胞功能障碍的核心调控因子，为治疗AD提供了新思路。

文献标题：Astrocytic calcium-dependent enzyme PAD2 governs microglia activity to exacerbate amyloid pathology via citrullinated vimentin

文献来源：福建医科大学 陈晓春/张静共同通讯

发表期刊：Immunity（IF=26.3，JCR Q1区）

发表时间：2026年3月

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2026.03.007

图形摘要

研究背景

阿尔茨海默症（AD）具有细胞外β-淀粉样蛋白（Aß）斑块积聚、tau蛋白神经纤维缠结等特征，慢性小胶质细胞介导的神经炎症是推动AD进展的关键因素。

AD早期小胶质细胞发挥保护作用，但长期激活会导致AD发展。

反应性星形胶质细胞也至关重要，Aβ斑块附近的星形胶质细胞与小胶质细胞相互作用形成自我放大的炎症循环。

蛋白质瓜氨酸化（PC，即精氨酸向瓜氨酸的转化）是先天免疫的关键调控因子，在五种哺乳动物肽基精氨酸脱亚氨酶（PAD）中，PAD2表达最为广泛。

多种神经退行性疾病中存在PC水平升高和PAD2活性异常，但其在神经退行性病变中作用机制不明。

关键研究发现

01、PAD2可能在AD患者大脑中的星形胶质细胞激活中发挥关键作用

关键枢纽蛋白筛选：对照组、无症状AD患者及AD患者大脑背外侧前额叶皮层（DLPFC）组织的蛋白质组学数据分析发现M11模块（细胞-细胞外基质相互作用）与疾病关联性最强（图1A）；蛋白质互作网络及交集分析发现DLPFC组织M11模块中PAD2的表达随AD病情进展逐渐升高（图1B-D）。

PAD2表达变化：AD患者脑组织PAD2蛋白表达显著高于对照组（图1E）；5×FAD小鼠（一种转基因AD模型）海马体中PAD2表达以及PAD2酶活性标志物随年龄增长而升高（图1F）。

PAD2细胞分布：免疫荧光显示，AD患者大脑中PAD2+星形胶质细胞比例更高（图1G-H），AD小鼠中PAD2+细胞主要定位于Aβ斑块附近（图1I-K），表明PAD2是AD进展的潜在生物标志物，在AD早期星形胶质细胞中高表达，且与Aβ斑块密切相关。

图1 AD患者与小鼠大脑Aβ斑块相关星形胶质细胞内PAD2表达上调

02、星形胶质细胞中的PAD2是AD发病机制和认知功能障碍的关键介导因子

PAD2敲除效率验证：选取cKO;AD（星形胶质细胞Padi2条件性敲除AD组）、f/f;AD（未敲除AD组）及f/f（未敲除对照组）小鼠，4.5月龄用他莫昔芬诱导Padi2敲除，6.5月龄免疫印迹检测海马体PAD2表达（图2A），结果显示f/f;AD小鼠PAD2表达高于f/f组，cKO;AD小鼠PAD2表达降低（图2B-C），实现较高敲除效率。

PAD2敲除对认知的改善：Morris迷宫和Y迷宫行为评估表明敲除Padi2能改善AD小鼠记忆和认知缺陷（图2E-F）；AD小鼠海马体PSD95（一种认知功能核心蛋白）表达降低，敲除Padi2后有所恢复（图2G）。

PAD2敲除导致Aβ沉积减少与小胶质细胞特征变化：硫黄素-S染色显示cKO;AD小鼠Aβ沉积减少（图2H），ELISA证实其前额叶皮层Aβ42浓度降低（图2I）；cKO;AD小鼠与斑块相关小胶质细胞数量减少、形态改变（图2J-L）。

图2 星形胶质细胞中条件性敲除Padi2可改善AD小鼠的神经病理特征

03、Padi2缺失可使星形胶质细胞的蛋白质稳态达到平衡，抑制炎症进程

PAD2对星形胶质细胞蛋白层面的影响：f/f、f/f;AD和cKO;AD小鼠的星形胶质细胞蛋白质组学分析显示，相比于f/f;AD组，cKO;AD组上调蛋白在负转录调控等功能富集，契合AD转录抑制情况；敲除Padi2可下调炎症、代谢相关蛋白，上调生长信号蛋白和表观遗传修饰因子；重叠分析获取了50种差异蛋白，代表着AD诱导改变后被PAD2敲除逆转的变化，参与关键神经元过程（图3A-B）。表明敲除Padi2可部分挽救AD小鼠星形胶质细胞的蛋白质组学特征。

PAD2对小胶质细胞基因层面的影响：对f/f、f/f;AD和cKO;AD小鼠的海马体进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）（图3C），进一步鉴定出3种激活小胶质细胞簇，其中cKO;AD组小胶质细胞中与干扰素免疫反应和抗原呈递相关基因显著下调，稳态小胶质细胞（HM）基因上调（图3D），氧化磷酸化相关基因表达显著升高（图3E）。随后对上述小胶质细胞簇进行差异表达基因（DEGs）分析，发现激活反应性小胶质细胞（ARM）1和ARM3核糖体相关基因高表达，ARM2上调脂质代谢相关基因，ARM3上调蛋白质向内质网定位相关基因，多数下调DEGs富集于神经免疫炎症等反应（图3F）。GSEA显示，cKO;AD小鼠中氧化磷酸化、产热、核糖体及内质网蛋白质加工相关基因上调，细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路相关基因下调（图3G）。

综合表明，敲除Padi2可促进小胶质细胞维持稳态并抑制其向炎症状态转变。

图3 Padi2缺失恢复星形胶质细胞蛋白质稳态平衡，并逆转小胶质细胞激活状态

04、PAD2驱动小胶质细胞促炎症反应，波形蛋白（vimentin）是PAD2的关键作用底物

PAD2对Aβ摄取的影响：用Me-XO4标记纤维状Aβ，流式细胞术分析发现，敲除Padi2显著增加AD小鼠中Me-XO4阳性、CD11b阳性、CD45阳性小胶质细胞/巨噬细胞比例（图3H），促进其对Aβ的摄取。

PAD2过表达星形胶质细胞分泌物对小胶质细胞功能的影响：Padi2过表达的星形胶质细胞条件培养基显著提高小胶质细胞促炎细胞因子释放水平（图4A-B），降低原代小胶质细胞对Aβ42-555的吞噬摄取（图4C-D）。

波形蛋白为PAD2候选底物与互作靶标：免疫印迹和ELISA分析发现，AD小鼠海马组织中瓜氨酸化波形蛋白（Cit-vimentin）和波形蛋白水平升高（图4F-G），敲除Padi2后降低（图4H-I）。免疫共沉淀证实PAD2与波形蛋白存在直接相互作用，PAD2剂量依赖性地提升波形蛋白瓜氨酸化水平（图4J-O）。

图4 鉴定波形蛋白（vimentin）为PAD2的候选作用底物

05、Cit-vimentin会触发小胶质细胞炎症反应并加重Aβ病理改变

PAD2介导的Cit-vimentin对小胶质细胞功能的影响：将Padi2和Vim质粒共转染至293T细胞，用上清液处理小胶质细胞（图5A）。结果显示，PAD2增加促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）浓度，降低小胶质细胞对Aβ42-555的摄取，且该效应依赖波形蛋白（图5B-D）。

Cit-vimentin对Aβ病理改变和小胶质细胞激活的影响：对AD小鼠脑室内注射Cit-vimentin（图5E），发现Cit-vimentin显著增加脑组织Aβ沉积（图5F-G），增强野生型（WT）和AD小鼠小胶质细胞反应性，促炎细胞因子表达升高（图5H-J）。

综合表明，星形胶质细胞中PAD2通过Cit-vimentin诱导小胶质细胞促炎激活并降低其Aβ摄取。

图5 Cit-vimentin会激活小胶质细胞，并加剧Aβ病变

06、Cit-vimentin通过Toll样受体4（TLR4）依赖的方式导致小胶质细胞功能障碍

Cit-vimentin对海马组织基因层面的影响：对经Cit-vimentin处理的WT小鼠与AD小鼠海马组织进行Bulk RNA-seq，获取了差异表达基因（图6A），上调基因在细胞因子-细胞因子受体相互作用、抗原加工与呈递以及细胞黏附分子等通路中显著富集（图6B）；重叠分析与相关性分析显示，AD组与WT组间的DEGs和WT+Cit-vimentin组与WT+载体组间的DEGs具有高度重叠性和强正相关性，重叠上调基因包含补体通路成分（如C1qa、C1qb、C3等）（图6C-D）。

Cit-vimentin与TLR信号通路的关系：对scRNA-seq数据GSEA分析发现，星形胶质细胞中Padi2缺失导致AD小鼠小胶质细胞TLR信号通路下调，而经Cit-vimentin处理的海马组织和原代小胶质细胞中该通路显著上调（图6E），提示TLR或为介导Cit-vimentin诱导小胶质细胞功能障碍的关键受体。

TLR4的关键作用：给Tlr4-KO和WT小鼠注射Cit-vimentin（图6F），Tlr4-KO小鼠中Cit-vimentin诱导的小胶质细胞形态学激活和促炎细胞因子上调现象消失（图6G-I），RNA-seq显示DEGs在免疫应答、炎症反应相关通路富集（图6J-6K），且Tlr4-KO-Cit-vimentin组与WT-Cit-vimentin组间的DEGs与WT-Cit-vimentin组与WT-载体组间的DEGs具有大量重叠且呈负相关（图6L）。

Cit-vimentin对Aβ吞噬功能影响：WT-Cit-vimentin组和Tlr4-KO组原代小胶质细胞对Aβ42-555的吞噬功能均受损，Cit-vimentin处理未进一步降低Tlr4-KO小胶质细胞Aβ摄取（图6M）。

综合表明，由PAD2、Cit-vimentin诱导的小胶质细胞功能障碍依赖于TLR4信号通路。

图6 Cit-vimentin诱导TLR4依赖性的小胶质细胞功能障碍

07、PAD2抑制可减轻小胶质细胞激活、Aβ病理改变和认知缺陷

PAD2抑制剂对蛋白瓜氨酸化及基因表达的影响：给AD小鼠和WT小鼠脑室内注射AFM30a（PAD2抑制剂）（图7A），蛋白质免疫印迹和酶联免疫吸附检测显示，AFM30a减轻AD小鼠总蛋白和波形蛋白瓜氨酸化程度，降低波形蛋白表达，且不影响PAD2表达（图7B-C）。海马组织Bulk RNA-seq显示AD组与WT组小鼠间的DEGs与AD-AFM30a组与AD组小鼠间的DEGs呈负相关（图7D）。

PAD2抑制剂对胶质细胞的影响：免疫印迹与免疫荧光显示，AFM30a使AD小鼠胶质纤维酸性蛋白上调水平恢复（图7E、7L），Iba1和6E10免疫荧光表明AFM30a能减轻反应性小胶质细胞增生，逆转小胶质细胞变形虫形态（图7E-H）。

PAD2抑制剂对Aβ病理及认知功能的影响：硫黄素-S染色显示PAD2抑制能减少Aβ沉积（图7I），降低可溶性Aβ42含量（图7J）；水迷宫测试表明AFM30a能改善AD小鼠空间学习和记忆缺陷，恢复PSD95表达（图7K-L）。

综合表明，AFM30a通过抑制胶质细胞激活来改善AD神经病理改变。

图7 PAD2抑制可减轻小胶质细胞活化、β-淀粉样蛋白（Aβ）病理改变及认知功能障碍

结  论

本研究结合病理学检测、蛋白质组学分析、转录组测序分析和差异表达基因分析等技术，发现PAD2在AD患者大脑斑块星形胶质细胞中特异性上调，敲除或抑制星形胶质细胞中的PAD2基因能恢复小胶质细胞的稳态及认知功能。

PAD2介导的Cit-vimentin通过TLR4促进炎症并阻碍Aβ清除，指出PAD2是AD的潜在药物靶点，为阿尔兹海默症的早期诊断和治疗创新提供了参考框架。