产品描述

衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特征，体内所有的正常细胞都配备一种自动的自 我摧毁机制：在经过大约 60 次分裂之后，它们都会死亡。而细胞永生化是指体外培养的细 胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。 目前，使用最广泛的将正常细胞永生化的方法是：通过慢病毒感染等技术将外源性永生化基 因导入原代细胞内制备永生化细胞株，以达到使体外培养的原代细胞具有无限增殖能力的目 的。目前最常用的永生化基因有 SV40T 和人端粒酶逆转录酶 (hTERT)。

灵思生物为您提供永生化细胞制备一站式服务，让初学者也能快速制备永生化细胞 株。试剂盒包含 SV40T/hTERT 慢病毒(病毒滴度≥10⁸TU/mL)、病毒感染增强剂及嘌呤霉 素/潮霉素。

产品信息

 产品组分

 运输与保存方法

干冰运输。收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒液放置于 4℃保存(一周内使用完 最佳)，如需长期保存请分装后放置于-80℃可保存一年，嘌呤霉素、潮霉素及病毒感染增 强剂放置于-20℃可保存一年。

注： 反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低 10%~50%)，因此病毒在使用过程中应尽 量避免反复冻融。灵捷思生物对慢病毒液已经进行了分装(50μL/tube)，收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。

实验流程 (以 LJSCI-001 试剂盒为例)

1) 目的细胞准备：感染前一天，将目的细胞接种到合适的细胞培养板中，当细胞汇合度约 50%-70%时准备感染；

2) 目的细胞的感染(以 12 孔板一个孔为例) ：将孔内原有培养基弃去，将 50 μL 慢病毒液 与 450 μL 完全培养基混合后加入孔内，感染 4h 后将培养基补足至 1mL(感染过程中可根据需要加入病毒感染增强剂，终浓度通常为 8 μg/mL)；

3) 观察感染情况(可选) ：感染 48~72h 后，带有 EGFP 的病毒可以在荧光显微镜下观察EGFP 的表达；

4) 永生化细胞株的筛选：

当细胞有绿色荧光时加入嘌呤霉素进行筛选，嘌呤霉素的终浓度视不同细胞而定，常规范围在 2~20 μg/mL（LJSCI-002试剂盒包含的病毒液不带EGFP，可在病毒感染 72h 后进行筛选)。LJSCI-003 试剂盒在病毒感染 72h 后加入潮霉素进行筛选，常规范围在 50~1000 μg/mL。根据细胞的生长状态或荧光比例，适当调整嘌呤霉素或潮霉素的使用浓度，进行多轮筛选以获得生长状态优良的细胞株。对获得的永生化细胞株进行 qPCR 检测 SV40T 或 hTERT 基因的表达。

对于生长速度很慢或传代次数很少的原代细胞，可以不用加嘌呤霉素进行筛选，因为这些原代细胞会随着时间延长逐渐死亡，存活下来的细胞都是永生化的细胞。

5) 永生化细胞的保存：将筛选后的永生化细胞扩大培养，分批冻存即可。

病毒小体积感染表

 注意事项

1. 构建永生化细胞株时，可先用原代细胞筛选嘌呤霉素或潮霉素的最低杀伤浓度，为后期 筛选永生化细胞株做好准备。

2. 病毒的使用体积取决于细胞的易感程度，如果感染率低，可以尝试加大病毒感染体积，也可以进行多次感染，即首次感染 48h 后再次加病毒感染。

3. 为了您的安全，实验操作过程应在生物安全柜中完成，并做好个人防护，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。所有实验废弃物均需要进行灭菌处 理。

4. 实验完毕后请用消毒液清洗双手。

常见问题解析与经验分享

1、 问：是不是所有原代细胞都可以用该试剂盒进行永生化诱导实验？

答：该永生化试剂盒选用两种常用的永生化慢病毒进行永生化诱导实验，但并非所有原代细胞都可以实现永生化，且不同原代细胞进行永生化时选择的慢病毒也会有不同。

2、 问：永生化细胞和原代细胞形态不一样，检测某些基因的表达也有差异，为什么？

答：原代细胞永生化后细胞形态发生变化是很正常的。因为很多原代细胞只能传2-4代就会严重变形，永生化后可以让细胞形态保持稳定。在细胞获得永生化后，肯定会改变某些基因的表达。所以在进行下游实验时需要指出所用的细胞来源，是原代细胞还是永生化细胞，且需要根据实验目的去选择细胞种类。

3、 问：不清楚自己的原代细胞用哪种慢病毒感染会更好？

答：SV40T病毒构建永生化细胞株效率及成功率会更高，且筛选周期短；TERT病毒构建永生化细胞株成功率会低一些，且筛选周期会长；建议可以选择组合装，两种病毒都尝试。

4、 问：为什么购买了试剂盒，但就是筛选不到永生化细胞株？

答：首先，不是所有原代细胞都适合做永生化；第二，筛选经验问题，可以继续阅读后续操作经验问题；第三，可以选择由本公司代为构建永生化细胞株。

5、 问：三种试剂盒，该怎么选择？

答：如果后续实验对荧光没有要求的话，建议选择带荧光的病毒，方便观察；如果后续实验不能有荧光的话，就选择不带荧光的病毒。对于选择SV40T还是hTERT病毒，首选SV40T，也可以两种病毒混合购买。

6、 问：收到病毒后，如果溶解了一支，但没有用完，怎么保存？

答：如果每次使用病毒量少，建议分装成更小份-80度冰箱保存。

7、 问：构建永生化细胞时，选择多大孔板更适合？

答：如果原代细胞量大，建议使用12孔以上的细胞板；如果细胞很珍贵，且量很少，可以选择96孔板或48孔板。

8、 问：原代细胞密度及加入病毒体积必须固定吗？

答：不同细胞的感染率以及生长速度都会不一样，必要时可以用96孔板做几个梯度，感染时细胞密度的选择可以根据细胞生长速度决定。

9、 问：病毒感染增强剂必须加吗？浓度也是固定的吗？

答：感染过程中根据需要可以加入病毒感染增强剂，终浓度一般为8μg/ml。如果出现细胞死亡现象，可以不加或降低浓度。有条件的建议实验前进行预实验检测病毒感染增强剂对原代细胞是否有致死性。=

10、问：为什么48h后荧光很少或几乎看不到，加嘌呤霉素/潮霉素筛选后细胞几乎全部死亡？

答：对于不同的原代细胞，慢病毒感染效率也是不一样的，不能完全照搬说明书，可以进行适当优化。首先，在病毒感染时可以加大病毒体积，或者选择多次感染；第二，病毒感染时可以减小感染体积；第三，可以选择延长观察的时间，在72或96h观察荧光，期间如果细胞生长过密可以选择传代；第四，筛选药物浓度选择问题，可以先在原代细胞上进行药物浓度摸索，选择最佳浓度进行永生化细胞株的筛选；第五，如果担心药物加进去后细胞不死亡或者死亡过多，可以在细胞感染病毒的48-96h进行传代，分接多个细胞孔，再按不同浓度进行加药筛选；第六，早期筛选可以先不加药物筛选，待细胞生长稳定后再进行分孔加药筛选，因为有些原代细胞在感染早期，表达药物抗性基因弱，生长速度还很慢，过早加入药物后会出现死亡或生长停滞，最终导致构建失败；第七，如果前期实验证明原代细胞只能生长2-4代就会停止生长，对于这类细胞我们可以选择不加药物进行筛选，只需要待细胞长满后进行传代，选择5代后生长旺盛的细胞进行冻存及检测即可；第八，加药物筛选过程中，也是需要不断观察和调整药物浓度的，如果加药组细胞死亡太多，且状态差，可以选择换液，不加药物，待细胞状态恢复后再加药；第九，细胞死亡过程中会出现碎片及一些颗粒物，属于正常情况，后面每次换液时需要用PBS洗涤；第十，需要提高原代细胞的纯度及质量，纯度可以通过免疫荧光进行检测，质量主要指细胞活力，是否有污染，特别是支原体污染对后续筛选过程有很大影响，必要时需要添加去除支原体试剂。